آزمایشات شامل تعیینpH، رشد جمعیت میکروبی و مقادیر آفلاتوکسین بوده که مطابق روش‌های زیر انجام گردید.
3-5-3-1- آزمون تعیین pH
جهت انجام این آزمون از روش استاندارد ملی ایران به شماره 2852 با استفاده از PH متر (مدل Metrohm) اندازه گیری شد . مقدار 5 گرم از شربت را وزن کرده ، داخل ارلن ریخته و بعد از کالیبره کردن pHمتر ، pHنمونه‌ها ساعت به ساعت قرائت شد .
3-5-3-2- آزمون رشد جمعیت میکروبی
جهت انجام این آزمون برای لاکتوباسیلوس رامنوسGGاز روش استاندارد ملی ایران به شماره11325 استفاده شد . رقت سازی با محلول رینگر ( قرص رینگر شرکت Merck) انجام گرفت و از رقت های ( 4- ،6- ،8- ، 10-) بر روی محیط کشت MRS ( شرکت Merck ) هوازی به روش پورپلیت انجام شد و در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد به مدت 3-5 روز قرار گرفت .
برای رشد بیفیدوباکتریوم لاکتیس 12BBاز روش استاندارد فوق استفاده شد . رقت سازی با محلول رینگر ( قرص رینگر شرکت Merck) انجام گرفت و از رقت های ( 6- ،7- ،8- ، 9-) بر روی محیط کشت MRS ( شرکت Merck ) به روش پورپلیت انجام شد و سپس برای اینکه محیط بی هوازی شود از نوار پارا فیلم استفاده شد و در نهایت در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد به مدت 3-5 روز قرار گرفت .
3-5-3-3- تهیه استاندارد کاری آفلاتوکسین M1 جهت سنجش مقادیر آفلا توکسین
برای ارزیابی میزان آفلاتوکسین در نمونه ها، هم چنین در نشانه گذاری (اسپایک)78 جهت تعیین صحت هر آنالیز، نیازمند استفاده از محلول های استاندارد با غلظت دقیق، جهت بررسی بود. در این پژوهش، دو محلول استاندارد ppb100 وppb 1 تهیه گردید و جهت اطمینان از صحت غلظت ها، میزان غلظت با محلول های آماده تهیه شده از کمپانی آلفا استار دانمارک توسط دستگاه HPLC بررسی گردید. محلولها به ترتیب تا 3 و1 ماه در دمای کم تر از 4 درجه سیلیسیوس قابل نگهداری است.
3-5-4- ملاحظههای ایمنی و احتیاطات79
جهت رفع آلودگی از سطوح و ظروف مورد استفاده در آزمایش تعیین آفلاتوکسین کلیه اقدامات ذکر شده به دقت رعایت گردید.
از آن جایی که سم آفلاتوکسین شدیدا به نور حساس می باشد، در طی انجام تمام آزمایشهاتا حد ممکن، محیط آزمایشگاه را تاریک کرده یا با استفاده از فویلهای آلومینیومی پنجره ها پوشانده شد تا از ورود نورUV ممانعت گردد یا اینکه ظروف با فویل آلومینیوم پوشانده شد.
لازم به ذکر است که در آزمایشگاه استفاده از لامپ فلورسنت مانعی ندارد.
ظروف حاوی محلول های کاری آفلاتوکسین، با استفاده از فویل یا نگهداری در جاهای تاریک،از نور محافظت گردید و حداقل در دمای کم تر از 4 درجه سیلیسیوس نگهداری شد.
تمام ظروف شیشه ای مورد استفاده در آزمایش قبل از استفاده می باید اسید شویی شده باشد. بنابراین با استفاده از اسید سولفوریک 2 مولار، حداقل 3 مرتبه شستشو شده و در نهایت با آب کافی، برای خنثی سازی اسید آبکشی گردید و جهت اطمینان از عدم باقیمانده اسید در ظروف، pH با استفاده از کاغذ pH متر کنترل شود.
برای شستشوی ظروف، ظروف باید آن ها را به مدت 2 ساعت در محلول هیپوکلریت سدیم یک درصد غوطه ور ساخته و شستشو با مقدار زیادی آب و در نهایت با 3 تا 4 بار آبکشی با آب مقطر انجام شود.
قبل از استفاده از کلیه محلول ها دمای ظرف و اتاق همسان سازی شد تا از تغییر غلظت، جلوگیری گردد.
قبل از تزریق محلول نمونه حاصل از آماده سازی آن بهوسیله فیلتر سر سرنگی 45/0 میکرونی فیلتر شده و سپس به دستگاه تزریق شد.
در کلیه مراحل آنالیز دستگاهی از پیش ستون HPLC استفاده گردید.
حلالها را قبل از استفاده در دستگاه HPLC با سیستم صافی با 45/0 میکرون صاف کرده و به مدت 15 دقیقه در حمام التراسونیک قرار داده شد.
لازم است، تمامی تجهیزات و ظروف مورد استفاده در این آزمایش می بایست دارای گواهی کالیبراسیون از مرجع ذیصلاح باشد و تمامی معرف ها می بایست مناسب کار با دستگاه HPLCباشد.
3-5-6- آمادهسازی ستون های ایمونوافینیتی
این ستونها قبل از استفاده نیاز به فعال سازی دارند. فعال سازی با توجه به بروشور کارخانه سازنده بهطور معمول به کمک عبور10 میلی لیتر بافر نمکی فسفات از ستون، با جریان ثابت 1 تا 2 میلی لیتر در دقیقه صورت گرفت. سپس مایع حاوی آفلاتوکسین از ستون عبور داده شود.
ستونها در دمای 2-8 درجه سیلسیوس نگهداری شدند و حداکثر ظرفیت باندشان ng100 آفلاتوکسینM1می باشد، هنگامیکه 50 میلی لیتر نمونه حاویg/Lµ2 آفلاتوکسینM1 از ستون عبور داده شود. ستون هرگز نباید بازیافتی کم تر از 80% داشته باشد.

شکل3-2: ستون های ایمونوافینیتی. نحوه فعال سازی و استفاده از این ستون ها
3-5-7- آزمایش های انجام شده بر روی بستنی
این آزمایشات شامل رشد جمعیت میکروبی و مقادیر آفلاتوکسین بوده که مطابق روش‌های زیر انجام گردید.
3-5-7- 1- آزمون کشت میکروبی
جهت انجام این آزمون برای لاکتوباسیلوس رامنوسGGاز روش استاندارد ملی ایران به شماره11325 استفاده شد . رقت سازی با محلول رینگر ( قرص رینگر شرکت Merck) انجام گرفت و از رقت های (6- ،8- ، 10-) بر روی محیط کشت MRS ( شرکت Merck ) هوازی به روش پورپلیت انجام شد و در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد به مدت 3-5 روز قرار گرفت .
برای رشد بیفیدوباکتریوم لاکتیس 12BBاز روش استاندارد فوق استفاده شد . رقت سازی با محلول رینگر ( قرص رینگر شرکت Merck) انجام گرفت و از رقت های (7- ،8- ، 9-) بر روی محیط کشت MRS ( شرکت Merck ) به روش پورپلیت انجام شد و سپس برای اینکه محیط بی هوازی شود از نوار پارا فیلم استفاده شد و در نهایت در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد به مدت 3-5 روز قرار گرفت .
3-6- طرح آماری
در این پژوهش، 2 متغیر مستقل زمان و نمونه به عنوان متغیرهای مستقل و جمعیت میکروبی در ساعت های اولیه و در طی 3 هفته و همچنین pH به عنوان متغیرهای وابسته شناخته می‌شوند. در صورتی که زمان به عنوان یکی از متغیرهای مستقل بررسی گردد، آزمون مورد استفاده “آزمون اندازه گیری های مکرر” می‌باشد ولی با توجه به این که میانگین داده ها در شرایط اولیه اختلاف معنی داری نداشتند، به جای آن از آزمون تجزیه و تحلیل واریانس دو طرفه (Univariate Analysis of Variance) استفاده گردید. ریز نتایج آماری در پیوست آمده است. کلیه نتایج با کمک نرم افزار آماری SPSS نسخه 21 انجام شده است. این پژوهش در طرح آماری کامل و هر آزمون در 3 تکرار انجام شده است.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   پایان نامه با موضوع دستور زبان، فعل مجهول

فصل چهارم
نتایج و بحث

4-1- نتایج بدست آمده از مرحله کالیبراسیون دستگاه HPLC و اندازهگیری آفلاتوکسین در شیر
4-1-1- نتایج حاصل از ترسیم منحنی کالیبراسیون و محدودیت های تشخیص و شناسایی
رسم منحنی با تزریق های متوالی غلظت‌های مناسب 05/0، 1/0، 5/0، 1، 2، 3، 4، 6، 8، 10، 15 و 20 ppb انجام شد. نتایج مربوط به کالیبراسیون در نمودار (4-1) و جدول (4-1) نشان داده شده است.

نمودار4-1 : نمودار منحنی کالیبراسیون (داده های حاصل از آنالیز دستگاه)

جدول 4-1 : مقادیر حاصل از نتایج آفلاتوکسین در دستگاه HPLC
طبق داده های بدست آمده از منحنی کالیبراسیون، انطباق بسیار مناسب در داده های ترسیم شده در منحنی مشاهده گردید. معادله خط بدست آمده 263/0 + x 582/0 = y و 9999/0 =2r بدست آمد.
4-1-2- بررسی میزان گزینش پذیری و تداخلات
گزینش پذیری جهت تمایز بین آنالیت مورد نظر و ترکیبات نزدیک به آن (مانند ایزومرها) یا تداخل یا ممانعت ترکیبات موجود در ماتریکس بسیار مهم می‌باشد.گزینش پذیری یکی از مسائل و مشکلات بسیار مهم می‌باشد که جهت انجام آزمایشات دقیق باید این مشکل رفع گردد. به عنوان مثال روش‌های تجزیه ای پیشنهاد شده توسط ISIISAN به عنوان روش مرجع جهت آنالیز آفلاتوکسینM1 در نمونه‌های شیر خام گاو، گزینش پذیری کمی را نشان می‌دهد. در حقیقت در کروماتوگرام های برخی از نمونه‌های شاهد (تست تشخیصی آفلاتوکسین آن‌ها منفی بود)، تداخل ماتریکس در زمان باز داری همان آنالیت دیده شد (ISTISAN Report 96/34, 1996).
گزینش پذیری از نظر وجود ترکیبات طبیعی موجود (از نظر وجود متابولیتها، ترکیبات درونی و . . .)، با آنالیز 20 نمونه، شاهد از بستنی بدست آمده از شیر فاقد آفلاتوکسین، بستنی دارای ng/kg 3 آفلاتوکسین M1 و نمونه بستنی دارای ng/kg 50 آفلاتوکسین M1.، فاقد هر گونه تداخلی در آنالیز بود و تداخل ترکیبات ماتریکس در زمان باز داری آفلاتوکسین M1در هیچ نمونه ای دیده نشد. که به ترتیب در نمودار های(4-2، 4-3 و 4- 4) آمده است.

نمودار 4-2 : کروماتوگرام بدست آمده از نمونه بستنی تهیه شده از شیر گاو فاقد آفلاتوکسین M1
فاز متحرک شامل آب، استونیتریل و متانل به نسبت 55: 15:30 بود.

نمودار 4-3 : کروماتوگرام بدست آمده از نمونه بستنی دارای ng/kg 3 آفلاتوکسین M1
فاز متحرک شامل آب، استونیتریل و متانل به نسبت 55: 15:30 بود.

نمودار 4-4 : کروماتوگرام بدست آمده از نمونه بستنی دارای ng/kg 50 آفلاتوکسین M1
فاز متحرک شامل آب، استونیتریل و متانل به نسبت 55: 15:30 بود.

4-2- ارزیابی تغییرات pH در مرحله گرمخانه گذاری
نتایج حاصل از اندازه گیری pH پس از افزودن استارتر پروبیوتیک و آفلاتوکسین در سه سطح (ppb1/0، 05/0، 0) در جدول (4-2) آمده است. با توجه به نتایج آنالیز آماری جدول (4-2) و پیوست‌های (الف- 1، الف- 2، الف- 3، الف-4) هر دو متغیر زمان و غلظت آفلاتوکسین به صورت تکی بر pH به صورت معنی داری تاثیر دارند (05/0p).

جدول شماره 4-2 : اثر زمان و غلظت آفلاتوکسین بر pH
زمان (ساعت)


2
3
4
6
9

شاهد
46/6±10/0 aA
13/6±10/0 bB
93/5±10/0 bcB
84/5±08/0 cB
77/5±09/0 cC
53/5±09/0 dB
آفلاتوکسین با غلظت 0.05 ppb
47/6±08/0 aA
16/6±09/0 bB
99/5±07/0 cB
89/5±09/0 cB
81/5±08/0 dB
57/5±08/0 eAB
آفلاتوکسین با غلظت 0.1 ppb
46/6±10/0 aA
26/6±10/0 bA
08/6±09/0 cA
95/5±08/0 cdA
90/5±09/0 dA
68/5±06/0 eA
داده ها نشان دهنده میانگین ± انحراف استاندارد می باشند. اختلاف در حروف لاتین کوچک نشاندهنده اختلاف معنی دار بین میانگین‌ها در طول زمان و اختلاف در حروف لاتین بزرگ بیانگر اختلاف معنی دار بین میانگین های نمونه‌ها به ازای مقادیر آفلاتوکسین می‌باشد.

نمودار 4-5: اثر زمان و غلظت آفلاتوکسین بر pH
طبق نمودار (4-5) مدت زمان تخمیر برای رسیدن به pH 5/5 در نمونه بستنی‌های با غلظت (ppb 05/0 ، 0) 9 ساعت بود. اما در بستنی حاوی آفلاتوکسین با غلظت ppb 1/0 بیشتر شد (10 ساعت)، که اضافه شدن این یک ساعت به زمان تخمیر در نمونه بستنی دارای آفلاتوکسین با غلظت ppb 1/0 ممکن است به این دلیل باشد که سرعت رشد لاکتوباسیلوس رامنوس GG و بیفیدوباکتریوم لاکتیس 12BB در این نمونه‌ها تفاوت دارد.
بنابر مطالعات انجام گرفته توسط راسیک و همکاران (1991)، اسیدلاکتیک عامل افزایش اسیدیته ماست است که به میزان بالایی توسط باکتری‌ها تولید می‌شود. همچنین در مطالعه دیگری که توسط گواریس و همکاران (2001) انجام گرفت تفاوت در مدت زمان تخمیر نمونه‌های ماست حاوی آفلاتوکسین به دلیل تفاوت سرعت رشد استرپتوکوکوس ترموفیلوس در این ماست‌ها می‌باشد. نتایج آن‌ها نشان داد که سرعت رشد استرپتوکوکوس ترموفیلوس تحت تاثیر غلظت بالاتر آفلاتوکسین M1 قرار می گیرد نه غلظت کمتر آفلاتوکسین M1. در مقابل سرعت رشد لاکتوباسیلوس بولگاریکوس تحت تاثیرغلظت آفلاتوکسین M1 قرار نمی گیرد. همچنین بانینا و ساتیک(1979) و ال دیب (1989) ، مشاهده کردند که توانایی تخمیر باکتری‌های اسیدلاکتیکی که در ماست‌های حاوی AFB1 رشد کرده اند کاهش

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید